OJIP葉綠素熒光快速誘導(dǎo)曲線測量技術(shù)最新研究進展

——從單點測量到二維成像測量

葉綠素熒光測量技術(shù)是目前植物/藻類光系統(tǒng)功能、光合電子傳遞相關(guān)研究中*的重要技術(shù)，同時也廣泛用于作物抗逆育種等研究中。葉綠素熒光技術(shù)有三種主要測量技術(shù)路線：PAM熒光淬滅動力學(xué)曲線、OJIP快速熒光誘導(dǎo)曲線和QA-再氧化動力學(xué)曲線分析，分別對應(yīng)光系統(tǒng)運行機理的不同方面。

OJIP快速熒光誘導(dǎo)曲線測量要求對樣品經(jīng)過暗適應(yīng)后的最小熒光上升到最大熒光這一過程進行快速檢測。這一個過程一般在1-2秒即可完成，儀器檢測器的最高靈敏度要求達到100 000次/秒以上。OJIP快速熒光動力學(xué)曲線部分參數(shù)及其意義： Fo、Fj、Fi、P或Fm、Vj、Vi、Mo、Area 、Fix Area、Sm 、Ss 、N（QA還原周轉(zhuǎn)數(shù)量）、Phi_Po 、Psi_o 、Phi_Eo、Phi_Do、Phi_pav、ABS/RC（單位反應(yīng)中心的吸收光量子通量）、TRo/RC（單位反應(yīng)中心初始捕獲光量子通量）、ETo/RC（單位反應(yīng)中心初始電子傳遞光量子通量）、DIo/RC（單位反應(yīng)中心能量散失）、ABS/CS（單位樣品截面的吸收光量子通量）、TRo/CSo、RC/CSx（反應(yīng)中心密度）、PI_ABS（基于吸收光量子通量的“性能"指數(shù)或稱生存指數(shù)）、PIcs（基于截面的“性能"指數(shù)或稱生存指數(shù)）等。

現(xiàn)在應(yīng)用*的OJIP快速熒光誘導(dǎo)曲線測量儀器主要為FluorPen和Handy PEA葉綠素熒光儀。伊利諾伊大學(xué)厄巴納-香檳分校G. Govindjee教授與印度賈瓦哈拉爾尼赫魯大學(xué)合作，比較這兩種儀器的OJIP曲線測量結(jié)果，以此分析影響OJIP曲線測量的因素。這一研究得到了光合研究Hartmut K. Lichtenthaler教授的建議指導(dǎo)，發(fā)表于2021年《Photosynthetica》。

通過對兩種儀器對擬南芥OJIP曲線的測量結(jié)果分析，他們認為有三個因素會造成OJIP曲線測量結(jié)果的差異：

1. 原初熒光Fo的估測時間點：20μs、50μs或推測的時間零點；

2. 測量OJIP的飽和脈沖光強：100%、80%、50%、30%和20%光強，同時兩種儀器的100%光強也有差異，FluorPen約為3120 ± 87 µmol(photons) m^–2 s^–1，而Handy PEA只能達到2890 ± 70µmol(photons) m^–2 s^–1。

3. 由于測量光源波長造成的葉片吸收率差異：FluorPen為470nm藍光，Handy PEA為650nm紅光，而470nm藍光具有更高的葉片吸收率。

通過比較OJIP曲線計算的Fv/Fp（即最大光化學(xué)效率Fv/Fm）可以發(fā)現(xiàn)：在不同光強下，FluorPen測量得到的Fv/Fp均高于0.8（0.823 ± 0.0018至0.837 ± 0.0016），而Handy PEA測得的Fv/Fp則有很大一部分低于0.8（0.793 ± 0.003至0.812±0.0016），尤其在飽和脈沖光強較低時尤為嚴重。對于Fv/Fm的數(shù)值范圍，雖然不同文獻中有所差別，但對于未受脅迫、生長良好的高等植物，普遍共識Fv/Fm要高于0.8，最高點應(yīng)能達到0.83-0.84。由此可見Handy PEA的數(shù)據(jù)結(jié)果有低估Fv/Fm的問題。

文章中還特別指出，2019年捷克科學(xué)院Küpper教授與PSI公司合作，將超高靈敏度成像傳感器與FluorCam葉綠素熒光成像技術(shù)結(jié)合，實現(xiàn)了OJIP快速熒光誘導(dǎo)曲線的直接測量成像測量。將OJIP測量從傳統(tǒng)熒光儀的單點測量，擴展到對整個葉片乃至整株植物的二維整體測量。比起非成像測量，這一最新的熒光成像技術(shù)能夠評價測量參數(shù)的異質(zhì)性、發(fā)現(xiàn)葉片上或大或小的漸變梯度，從而對植物受脅迫程度和發(fā)展做出更加準確的評估。同時，文章進一步指出，推薦使用葉綠素熒光成像技術(shù)還由于成像技術(shù)能夠測量真實的光系統(tǒng)II量子產(chǎn)額。

目前，使用這一革新性的葉綠素熒光成像技術(shù)已經(jīng)進行了大量關(guān)于重金屬對光合作用抑制機理的研究。赫爾辛基大學(xué)等則利用這一新技術(shù)開展了擬南芥光系統(tǒng)對臭氧的響應(yīng)機制等一系列研究。

參考文獻：

1.Padhi B, et al. 2021. A comparison of chlorophyll fluorescence transient measurements, using Handy PEA and FluorPen fluorometers. Photosynthetica 59 : 39-48,

2.Küpper H, et al. 2019. Analysis of OJIP Chlorophyll Fluorescence Kinetics and QA Reoxidation Kinetics by Direct Fast Imaging. Plant Physiology 179: 369-381

3.Morales LO, et al. 2021. Ozone responses in Arabidopsis: beyond stomatal conductance. Plant Physiology 186(1): 180-192

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